刺梨果中的黄酮能很好地清除各种活性氧吗？

用化学发光及分光光度法研究了刺梨黄酮对活性氧自由基O2-.,H2O2,DPPH·的清除作用,以及对H2O2诱导的红细胞氧化溶血和肝组织脂质过氧化产物(MDA)形成的抑制作用。结果表明,刺梨黄酮能很好地清除各种活性氧,并能显著抑制红细胞氧化溶血以及肝组织MDA的产生。其是一种很好的抗氧化剂。

刺梨(RoseroxburghiiTratt.)为蔷薇科蔷薇属野生植物,落叶灌木。生长于我国云南、贵州等西南省份山区,尤以贵州资源最为丰富。近年来,浙江台州地区亦已引种成功

。

目前刺梨果实浓缩汁正被开发为多种医药制剂、功能性食品和健康饮料,应用于心血管疾病、癌症病人的辅助治疗和日常保健。研究发现刺梨所含成分具有提高免疫功能1、延缓衰老2、抗氧化抗动脉粥样硬化3、抗癌防癌4、降血脂等作用。但以上多是基于刺梨汁的研究,目前对于其活性成分黄酮类化合物的研究还较少。

本研究从刺梨干燥果实中提取得到了刺梨黄酮,并对其体外抗氧化作用进行了初探,说明刺梨黄酮具有抗氧化作用。

一、材料

1.1　刺梨黄酮(FlavonoidsofRosaroxburghiiTratt.FRR)

刺梨成熟果实八月份采自浙江台州,经本院植物分类学李宏庆副教授鉴定,风干后打成粗粉,以5倍体积的石油醚回流脱脂3～4次,以60%的乙醇回流提取4次,提取液浓缩后过大孔树脂柱,水洗去杂后,再以40%乙醇洗脱,洗脱液浓缩真空干燥即得黄酮粗品,以芦丁为标准测得黄酮含量≥60%。

1.2　试剂

黄嘌呤、鲁米诺和四乙氧基丙烷(TEP)均系Sig-ma产品,黄嘌呤氧化酶由本系微生物教研室提供,过氧化氢等其它试剂均为国产分析纯。

1.3　仪器

SHG-1型生物化学发光测量仪(上海技术监督局制造),721型分光光度计(上海市第三分析仪器厂)、WH-85型旋涡混合器(上海手术器械厂)、高速台式离心机(上海安亭医用仪器厂)。

二、方法

2.1 FRR对H2O2的清除作用

H2O2-鲁米诺化学发光体系396DOI:10.16333/j.1001-6880.2005.04.002，在不同浓度的样品各100μL中,加入300μL磷酸缓冲液(pH8.0),再加入100μL0.18%H2O2,混匀。37℃保温3min,再加入500μL4×10-4mol/L鲁米诺溶液启动化学发光反应,测量10s的积分发光强度(countsofper10seconds,简称CP10S),以无样品的测量管的积分发光强度为对照,计算样品对本体系化学发光的抑制率。

2.2　FRR对O2-.的清除作用

黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-鲁米诺化学发光体系[9]用pH7.8的磷酸缓冲液配制鲁米诺、黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶,在不同浓度的样品各100μL中,加入750μL黄嘌呤溶液和100μL2×10-3mol/L鲁米诺溶液,混匀,再加入50μL黄嘌呤氧化酶启动化学发光反应。延迟10s发光,测量10s的CP10S,以无样品的测量管的积分发光强度为对照,计算样品对本体系化学发光的抑制率。

2.3　FRR对O2-.的清除作用

邻苯三酚自氧化的化学发光体系用0.1mol/L碳酸缓冲液配制鲁米诺使其浓度为1×10-3mol/L,邻苯三酚用三蒸水配制成6.25×10-4mol/L。测量前将pH10.2的碳酸缓冲液(含1mmol/LEDTA)与鲁米诺以体积比2:1混合,在测量管中加入不同浓度的样品各10μL及混合溶液940μL,最后加入50μL邻苯三酚启动发光反应。

延迟10s发光,测量6s的积分发光强度,以无样品的测量管的积分发光强度为对照,计算样品对本体系化学发光的抑制率。

2.4　FRR对1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)的清除作用

向2.5mLDPPH·溶液中加入不同浓度药液0.5mL(对照组加等量无水乙醇),总体积3mL,每组平行5管。摇匀后放置30min,测定517nm的吸光度(OD.)以2.5mL乙醇加同浓度药液作为本底。清除率(%)=[1-(A样-A本底)/A对照]×100%2.5　对H2O2诱导红细胞氧化溶血的影响[12]SD大鼠脱颈椎处死,眼眶取血,用肝素抗凝大鼠全血,用生理盐水2000rpm,5min离心洗涤3次,配成0.5%的红细胞悬液,实验分为对照组、不同浓度药物组,每组平行5管。

将红细胞悬液(0.5mL)与各浓度的药液(0.1mL)37℃温育10min后加100mmol/LH2O2继续温育1h,稀释4倍后离心,取上清液在415nm处测吸光度(OD.),以对照组为100%溶血计算加药后的溶血度和抑制率。2.6　对大鼠肝脏自发性和H2O2诱导脂质过氧化的影响SD大鼠脱颈椎处死,迅速取肝脏,在0～4℃下用生理盐水制成10%的组织匀浆。分组同上,每组平行5管,每管加0.5mL组织匀浆,各浓度药液0.1mL(对照组加等量生理盐水)混匀。

37℃温育2h,按硫代巴比妥酸(TBA)法测MDA含量,并计算抑制率。同前法制备10%肝匀浆,先在各管中加入10%肝匀浆0.5mL,各浓度药液0.1mL(对照组加等量生理盐水),37℃温育振荡反应15min,再向各管中加入(100mmol/L)H2O20.1mL,继续温育反应30min,同上测定MDA。

3　结果与分析

3.1　FRR对O2-.的清除作用

表1、2结果显示:经线性回归分析,在两个发光系统中不同浓度的FRR均能有效的清除O2且随浓度升高,清除率也逐渐提高,存在剂量依赖关系。

在邻苯三酚自氧化体系中IC50为17μg/mL,而在黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-鲁米诺化学发光体系中0.14μg/mL的FRR即可达到50%的发光抑制率。

表1　FRR在邻苯三酚自氧化化学发光体系中对O2-.的清除作用Table1　ThescavengingeffectsofFRRonO2-.in1,2,3-benzentriolauto-oxidationsystem浓度Concentrationμg/mL发光抑制率Inhibitionrate%IC50μg/mL线性回归分析Linearityanalysis00b1.254289a16.683011025.54Sb0.282369Sa8.8733041545.82r20.831448MSe1/213.89312057.5117F19.73154df44071.41SSR3808.555SSE772.07326081.69PF0.011316＊–　＊PF<0.053972005　Vol.17　No.4张晓玲等:刺梨黄酮的体外抗氧化作用

表2　FRR在黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶化学发光体系中对O2-.的清除作用Table2　ThescavengingeffectsofFRRonO2-.inxanthine-xanthineoxidasesystem浓度Concentrationμg/mL发光抑制率Inhibitionrate%IC50μg/mL线性回归分析Linearityanalysis00b155a15.56180.018.3Sb32Sa7.7058870.0533.36r20.855893MSe1/214.180240.140.145.10F23.75715df40.371.83SSR4777SSE804.31710.583.52PF0.008195＊-　-　　＊PF<0.053.2　FRR对H2O2和DPPH·的清除作用　　在H2O2-鲁米诺化学发光体系中(表3),FRR对H2O2的产生具有极显著的抑制作用,100μg/mL的FRR抑制率可达91.32%,其IC50为35μg/mL。FRR对1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)也具有显著的清除作用(表4),IC50为24μg/mL。

表3　FRR对H2O2的清除作用Table3　ThescavengingeffectsofFRRonH2O2inH2O2-luminalsystem浓度Concentration(μg/mL)发光抑制率Inhibitionrate%IC50(μg/mL)线性回归分析Linearityanalysis00b1.939637a6.6377141516.10Sb0.113916Sa6.4983712028.44r20.986391MSe1/210.07421355069.15F289.9156df48083.82SSR29423.46SSE405.959110091.32PF6.9773E-05＊-　-　　＊PF<0.05

表4　FRR对DPPH·的清除作用Table4　ThescavengingeffectsofFRRonDPPH·浓度Concentrationμg/mL发光抑制率Inhibitionrate%IC50μg/mL线性回归分析Linearityanalysis00b1.287506a7.60242013.85Sb0.238406Sa5.353967511.25r20.879392MSe1/210.095954241028.63F29.16517df42047.57SSR2972.7560SSE407.71325065.04PF0.00569＊-　-　　＊PF<0.053.3　FRR对红细胞氧化溶血的抑制作用　　H2O2可使红细胞发生氧化溶血作用,而抗氧化剂则可以抑制H2O2对红细胞的这种作用,降低溶血率。表5可见:2到50μg/mL的FRR均对红细胞的溶血有抑制作用,IC50为24μg/mL,其中50μg/mL的FRR抑制率可达96.03%,几乎完全抑制了H2O2的作用。3.4　FRR对肝组织自发和诱导产生脂质过氧化产物(MDA)的抑制作用　　肝组织可自发产生MDA,而加入100mmol/L的H2O2作用30min,产生MDA的量则极显著的增加(P<0.01),而加入不同浓度的FRR对自发和诱导产生的MDA均具有显著或极显著的抑制作用,其IC50分别为20μg/mL和21μg/mL。398天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　2005　Vol.17　No.4

表5　FRR对红细胞氧化溶血的抑制作用Table5　TheinhibitionoferythrocyteoxidativedamagebyFRR浓度Concentration(μg/mL)OD.溶血率Hemolysisrate%抑制率Inhibitionrate%空白Blank0.064±0.01　18.78-对照Control0.341±0.06aa100-20.313±0.0291.7410.1650.281±0.0482.3121.78100.237±0.04b69.4037.68200.192±0.02bb56.1953.94500.075±0.02bb22.0196.03　　aa与空白组比P<0.01　b与对照比P<0.05　bb与对照比P<0.01

表6　FRR对肝组织自发和诱导产生MDA的抑制作用Table6　Theinhibitionofthecontentofmalondialdehyde(MDA)inrathepatocytebyFRR浓度Concentrationμg/mL自发SpontaneityH2O2诱导InducementMDA量ConcentofMDAnmol/g抑制率Inhibitionrate%MDA量ConcentofMDAnmol/g抑制率Inhibitionrate%空白Blank–34.11±4.44-对照Control118.04±4.08-203.37±20.22aa-1106.68±5.93bb9.62176.67±11.61b13.13593.48±5.12bb20.80173.62±14.40b14.631075.97±2.79bb35.64134.02±6.10bb34.105022.45±1.32bb80.9840.81±3.17bb79.9310017.96±1.56bb84.7826.38±2.80bb87.03　　aa与空白组比P<0.01　b与对照比P<0.05　bb与对照比P<0.01

4　讨论　　细胞的正常代谢活动也会产生各种活性氧自由基,但正常情况下机体各种抗氧化酶或抗氧化剂能维持活性氧代谢的平衡。一旦这种平衡打破,造成体内活性氧积聚,即可引起机体病变。人类的多种疾病,包括肿瘤、心脑血管病、糖尿病、老年痴呆症以及衰老等都与活性氧自由基有关[14]。超氧阴离子自由基O2-.是生物体内最早产生的自由基,羟自由基(OH·)是最活泼也最具危害性的自由基,往往也更难清除,已发现许多抗氧化物质能清除O2-.,但却不能清除OH·自由基。氧化剂H2O2可通过Fenton反应产生活性更强的OH·[15],诱发多不饱和脂肪酸氧化,形成过氧化脂质(LPO)或引起红细胞膜脂质氧化、膜蛋白发生聚集,导致红细胞溶血。而MDA又是LPO的主要降解产物,所以通过测定MDA和红细胞溶血程度可判断OH·的多少。实验发现刺梨黄酮FRR对活性氧自由基O2-.,H2O2,DPPH·均具有很好的清除作用,并且对于红细胞的氧化溶血以及肝组织脂质过氧化产物的形成具有显著的抑制作用,说明其可以清除OH·抗脂质过氧化。因此FRR是一种很好的抗氧化剂,有望开发成为防治与自由基相关的各类疾病的功能性食品与药品。致谢:本实验所用发光系统仪器及试剂由本学院陈季武老师提供,特此感谢。

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